產品詳細描述
試劑盒內含：Annexin V，FITC結合物，PI Solution，10×Annexin V Binding Buffer
儲存條件：0-5℃，避光 (切勿凍存)
運輸條件：室溫
產品描述：細胞凋亡是指為維持有機體內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。正常情況下任何細胞在形成過程中發生的異常都會通過凋亡消除。例如體內的癌細胞增長為腫瘤的過程會受細胞凋亡的引導而被抑制。然而在抑癌基因p53出現問題時，凋亡就不會誘導發生，從而導致癌細胞的不斷增長。細胞凋亡可以通過細胞形態的變化或生物化學的變化來檢測。目前常用的指標有caspase活性變化、DNA碎片、***脂酰絲氨酸的外翻等。
Annexin V染色的細胞可以用于檢測細胞凋亡早期的細胞膜變化。在細胞凋亡早期，膜***脂酰絲氨酸由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種分子量為35-36 kD的Ca2+依賴性***脂結合蛋白，與***脂酰絲氨酸有高度親和力，可通過細胞外側暴露的***脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜特異性結合，因此Annexin V 被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。用綠色熒光FITC標記的Annexin V通過流式細胞儀或熒光顯微鏡可以檢測到細胞凋亡的發生。***化丙*** (Propidium Iodide, PI) 是一種核酸染料，PI只能透過凋亡晚期和死細胞的細胞膜，因此Annexin V和PI結合使用，可以區分凋亡早晚期的細胞及死細胞。
操作流程：
-懸浮細胞的操作流程
誘導凋亡的操作步驟
1.制備細胞 (Jurkat cell) 懸液 (1×106
cells/ml)
2.加入終濃度為1 μg/ml的凋亡誘導劑 (Staurosuporine)
3.在37℃下培養3.5 h。
* Staurosuporine用于誘導Jurkat cell凋亡。******誘導條件請根據實驗的細胞類型與誘導劑調整。
Annexin V染色操作步驟
1. 將細胞懸液轉移到離心管中，1,000 rpm離心3 min， 去除上清液。
2. 加入PBS，1,000 rpm離心 3 min，去除上清液。再重復本步操作一遍。
3. 用之前準備好的1×Annexin V Binding Solution制備細胞終濃度為1×106cells/ml的細胞懸液
細胞懸液體積根據實驗目的自行調整，一般推薦不少于500 μ l細胞懸液
4. 取100 ?l步驟3中制備的細胞懸液，加入到一個新的tube中。
5. 向細胞懸液中加入5 μl Annexin V,FITC結合物，再加入5μl PI Solution。
6. 室溫下避光培養15 min。
7. 加入400 μl 1×Annexin V Binding Solution，請在1 h內檢測。
-貼壁細胞的操作流程
誘導凋亡的操作步驟
1. 制備細胞 (Caco-2) 懸液 (1×106 cells/ml) 將細胞懸液接種到培養皿或者培養板中。
2. 在5% CO2培養箱中37℃預培養。
3. 加入終濃度為25 μmol/ml的凋亡誘導劑 (Cisplatin)。
4. 37℃培養4 days。
Annexin V染色操作步驟
1. 吸取培養皿或培養板中的上清液丟棄或轉移至微型 管中保存。
2. 用PBS洗細胞2次，丟棄或收集清洗液保存。
3. 用胰蛋白酶消化細胞。
4. 用適量的培養基或PBS將細胞懸液轉移至離心管中，如果第一步的上清液和第二步的清洗液沒有丟棄， 可以一并加入。
5. 1,000 rpm離心3 min，棄上清。
* Cisplatin用于誘導Caco-2 cell凋亡。******的誘導條 件請根據實驗的細胞類型與誘導劑調整
6. 加入PBS后1,000 rpm離心3 min，棄上清。重復本 步操作一遍。
7. 加入預先配好的1×Annexin V Binding Solution，制成終濃度為1×106cells/ml的細胞懸液。
* 細胞懸液體積根據實驗目的自行調整，一般推薦不 少于500 ?l細胞懸液。
8. 取100 μll步驟7中的細胞懸液，加入到新的tube中。
9. 向細胞懸液中加入5 μl Annexin V, FITC結合物，再 加入5 μl的PI Solution。
10. 室溫下避光培養15 min。
11. 加入400 μl 1×Annexin V Binding Solution，請在 1 h內檢測。
備注：1. 上清液及清洗液中可能含有細胞或凋亡細胞，可 以收集一起處理。
2. 離心后如果無法判斷tube中是否含有細胞？可以保留上清液，以防檢測時沒有細胞，進而得不到實驗結果。
-設定對照
1. 未染色細胞。
2. Annexin V, FITC染色細胞 (沒有PI)。
3. PI染色細胞 (沒有Annexin V-FITC)。
-流式細胞儀檢測
1. 加樣到流式細胞儀檢測，激發波長Ex = 488 nm；發 射波長Em = 530 nm。
2. Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道 (FL1) 檢 測；PI的紅色熒光通過PI 通道 (FL2或FL3) 檢測 (建議使用FL3)。
注意事項：
1. PI有潛在的致癌性，操作時請特別注意并采取必要的 防護措施。
2. Annexin V,FITC和PI均對光敏感。所有染色過程和培養過程均需避光。
3. 若細胞收集過程中使用胰酶，需設法去除殘留的胰酶，這些胰酶會消化并降解Annexin V, FITC，最終導致染 色失敗。
儲存條件 ：0-5℃，避光 (切勿凍存)
運輸條件：室溫
產品描述：細胞凋亡是指為維持有機體內環境穩定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡。正常情況下任何細胞在形成過程中發生的異常都會通過凋亡消除。例如體內的癌細胞增長為腫瘤的過程會受細胞凋亡的引導而被抑制。然而在抑癌基因p53出現問題時，凋亡就不會誘導發生，從而導致癌細胞的不斷增長。細胞凋亡可以通過細胞形態的變化或生物化學的變化來檢測。目前常用的指標有caspase活性變化、DNA碎片、***脂酰絲氨酸的外翻等。
Annexin V染色的細胞可以用于檢測細胞凋亡早期的細胞膜變化。在細胞凋亡早期，膜***脂酰絲氨酸由脂膜內側翻向外側。Annexin V是一種分子量為35-36 kD的Ca2+依賴性***脂結合蛋白，與***脂酰絲氨酸有高度親和力，可通過細胞外側暴露的***脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜特異性結合，因此Annexin V 被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。用綠色熒光FITC標記的Annexin V通過流式細胞儀或熒光顯微鏡可以檢測到細胞凋亡的發生。***化丙*** (Propidium Iodide, PI) 是一種核酸染料，PI只能透過凋亡晚期和死細胞的細胞膜，因此Annexin V和PI結合使用，可以區分凋亡早晚期的細胞及死細胞。
北京
